GAL4 typu dzikiego wiąże się wspólnie z GAL1-10 UASG in vitro.

    • Transkrypcja genów wymaganych  do wykorzystania galaktozy  w Saccharomyce s cerevisiae jest kontrolowana głównie  przez białko aktywujące transkrypcję GAL4 .
    • Sekwencje aktywujące  strumień w górę  dla galaktozy (UASG) większości genów GAL mają wiele miejsc  ,  którymi GAL4 może się  wiązać. W  tym raporcie porównujemy właściwości wiązania GAL4  typu dzikiego i pochodnych GAL4 niosących  N-końcową domenę wiążącą DNA z wieloma miejscami wiążącymi  DNA in vitro  .
    • Aby wyprodukować GAL4 typu  dzikiego , skonstruowaliśmy  rekombinowane  bakulowirusy  do ekspresji jonów komórkach owadów Stwierdzono , że zrekombinowana  GAL4 typu dzikiego  skutecznie wiąże się z oligonukleotydem zawierającym bliskie ksensu s 17  – merowe miejsce wiążące  DNA  GAL4 analizie przemieszczania elektroforetycznego  .
    • Eksperyment z odciskiem stopy ujawnił  , że GAL4 typu dzikiego wiążą się wspólnie  z czterema miejscami wiążącymi DNA GAL4  GAL1-10 UASG  ; jednak w przeciwieństwie do N-końcowego fragmentu GAL4 zawierającego tylko domeny  wiążące dimeryzacyjne z DNA wiąże się z  każdym z  tych  nieznacznie różnym  powinowactwem .
    • Wraz ze wzrostem stężenia GAL4 ( 1-147  ), cztery miejsca  są wypełniane  w następującej kolejności: miejsce  II,  miejsce IV,  miejsce I i  miejsce III . W eksperymencie GAL4  typu dzikiego kolejne cztery  miejsca są w  pełni zajęte przy mniej więcej tym samym  stężeniu białka.
    • W śladach GAL4  typu dzikiego na USAG, wzmocnienia i ochrona wrażliwych cięć  DNA są  wykrywalne między miejscami  III  IV co wskazuje na  tworzenie pętli między miejscami miejsca rozmieszczone na miare  _ _ 
    • Wiązanie GAL4 typu dzikiego do  silnego miejsca wiązania  bliskiego  sensu , jako wiązanie z sąsiednim  zmutowanym  miejscem zarówno w  przypadku zmiany ruchliwości elektroforetycznej jak odcisku stopy . GAL4( 1-147 ) i GAL4(1-147) połączone z częściami regionu aktywującego II GAL4’s były niezdolne do  wspólnego wiązania  DNA w naszym teście .
    • Wnioskujemy z obserwacji, że GAL4 typu dzikiego  ma  kooperatywną funkcję wiązania DNA, która różni się od funkcji wiązania i  dimeryzacji DNA lub aktywacji transkrypcyjnej i prawdopodobnie odgrywa  ważną rolę rola w precyzyjnej regulacji transkrypcji genu GAL .

    Klonowanie i ekspresja w Escherichia coli genu OGG1 Saccharomyces  cerevisiae , który koduje glikozylazę DNA, która wycina 7,8-dihydro-8-oksoguaninę i 2,6-diamino-4-hydroksy-5-N-metyloformamidopirymidynę.

    1. Szczep spontanicznego mutatora Escherichia coli (fpg mutY) zastosowano do sklonowania genu OGG1 z  S.accharomyces cerevisiae , który koduje aktywność glikozylazy DNA, która wycina 7,8-dihydro-8-oksoguaninę (8-OxoG) . E. coli (fpg mutY) transformowano przez bibliotekę DNA drożdży i wyselekcjonowano klony, które wykazywały zmniejszoną spontaniczną mutagenezę.
    2. Aktywność antymutatorowa była związana z pYSB10 rekombinowanym  plazmidem o wielkości 11 kbp  . Bezkomórkowe ekstrakty E. coli (fpg mutY) niosące pYSB10 posiadają aktywność enzymatyczną, która tnie 34 – merowy  oligonukleotyd zawierający pojedynczą 8-oksoG naprzeciwko cytozyny (8-OxoG/C).
    3. Fragment DNA drożdży o wielkości 1,7 kbp, który hamuje spontaniczną mutagenezę i nadmiernie wytwarza aktywność cięcia 8-OxoG/C, zsekwencjonowano i zmapowano na chromosomie XIII.
    4. Sekwencjonowanie DNA pozwoliło zidentyfikować otwartą ramkę odczytu, oznaczoną jako OGG1, która koduje białko składające się z 376 aminokwasów o masie cząsteczkowej 43 kDa. Gen OGG1 został wstawiony do plazmidu pUC19, dając pYS B110 . E. coli (fpg) niosące pYSB110 zastosowano do oczyszczenia białka Ogg1  z  S. cerevisiae  do pozornej jednorodności.
    5. Białko Ogg1 posiada aktywność glikozylazy DNA, która uwalnia 8-OxoG i 2,6-diamino-4-hydroksy-5-N-metyloformamidopirymidynę.
    6. Białko Ogg1 preferencyjnie nacina DNA, który zawiera 8-OxoG przeciwną cytozynę (8-OxoG/C) lub tyminę (8-OxoG/T). W przeciwieństwie do tego, białko Ogg1 nie nacina dupleksu, w którym adenina jest umieszczona naprzeciwko 8-OxoG (8-OxoG/A).
    7. Mechanizm rozszczepiania nici przez białko Ogg1 jest prawdopodobnie spowodowany wycięciem 8-OxoG, po którym następuje beta-eliminacja w powstałym miejscu apurynowym/apirymidynowym.

    Ligandy dla receptora beta-glukanu, Dectin-1, przypisane za pomocą „projektowych” mikromacierzy sond oligosacharydowych (neoglikolipidów) wytworzonych z polisacharydów glukanu.

    • Dectin-1 jest receptorem podobnym do lektyny typu C na leukocytach, który pośredniczy w fagocytozie i wytwarzaniu mediatorów zapalnych we wrodzonej odporności na patogeny grzybicze.
    • Dectin-1 nie zawiera reszt zaangażowanych w ligację wapnia, która pośredniczy w wiązaniu węglowodanów przez klasyczne lektyny typu C; niemniej jednak wiąże zymosan, bogaty w beta-glukan ekstrakt z  S. acharomyces  cerevisiae w postaci cząstek , a wiązanie jest hamowane przez polisacharydy bogate w beta1,3-lub zarówno beta1,3-, jak i beta1,6-glukozę.
    • Ligandy oligosacharydowe na glukanach rozpoznawane przez Dectin-1 nie zostały jeszcze dokładnie określone. Nie wiadomo również, czy Dectin-1 może wchodzić w interakcje z innymi rodzajami węglowodanów.
    • Zbadaliśmy to, ponieważ Dectin-1 wykazuje niezależne od glukanu wiązanie z podzbiorem limfocytów T i bierze udział w wyzwalaniu ich proliferacji.
    • Tutaj przypisujemy ligandy oligosacharydowe dla Dektyny-1 przy użyciu technologii mikromacierzy oligosacharydów opartych na neoglikolipidach, unikalnego podejścia do konstruowania mikromacierzy sond oligosacharydowych połączonych lipidami z pożądanych źródeł.
    • Generujemy „projektowe” mikromacierze z trzech polisacharydów glukanu, obojętnego, rozpuszczalnego glukanu wyizolowanego z  S . cerevisiae  i dwa bakteryjne glukany, kurdlan z Alcaligenes faecalis i pustulan z Umbilicaria papullosa, i stosuje się je w połączeniu z 187 różnymi sondami oligosacharydowymi o określonej sekwencji, głównie typu ssaczego.

    Recombinant S. cerevisiae TIM14

    CR26-10ug Novoprotein 10ug 242.4 EUR

    Recombinant S. cerevisiae TIM14

    CR26-1mg Novoprotein 1mg 2983.2 EUR

    Recombinant S. cerevisiae TIM14

    CR26-500ug Novoprotein 500ug 1935.6 EUR

    Recombinant S. cerevisiae TIM14

    CR26-50ug Novoprotein 50ug 595.2 EUR

    ATP Sulfurylase, S. cerevisiae Recombinant

    P1542-100 Biovision 100 µg 1548 EUR

    ATP Sulfurylase, S. cerevisiae Recombinant

    P1542-20 Biovision 20 µg 429.6 EUR

    Recombinant S. cerevisiae IFM1, GST, E.coli-1mg

    QP7172-ec-1mg EnQuireBio 1mg 2763.6 EUR

    Recombinant HPV-16 L1 Protein (S. cerevisiae)

    VAng-Lsx0270-100g Creative Biolabs 100 µg 4651.2 EUR

    Recombinant S. cerevisiae IFM1, GST, E.coli-10ug

    QP7172-ec-10ug EnQuireBio 10ug 391.2 EUR

    Recombinant S. cerevisiae IFM1, GST, E.coli-50ug

    QP7172-ec-50ug EnQuireBio 50ug 522 EUR

    Recombinant S. cerevisiae IFM1, GST, E.coli-100ug

    QP7172-ec-100ug EnQuireBio 100ug 848.4 EUR

    Recombinant S. cerevisiae IFM1, GST, E.coli-200ug

    QP7172-ec-200ug EnQuireBio 200ug 1338 EUR

    Recombinant S. cerevisiae IFM1, GST, E.coli-500ug

    QP7172-ec-500ug EnQuireBio 500ug 1816.8 EUR

    Recombinant S. cerevisiae SPT15 Protein, His, E.coli-1mg

    QP6764-ec-1mg EnQuireBio 1mg 2763.6 EUR

    Recombinant Human Insulin Protein, Untagged, S. cerevisiae-250mg

    QP10732-250mg EnQuireBio 250mg 458.4 EUR

    Recombinant S. cerevisiae SPT15 Protein, His, E.coli-10ug

    QP6764-ec-10ug EnQuireBio 10ug 391.2 EUR

    Recombinant S. cerevisiae SPT15 Protein, His, E.coli-50ug

    QP6764-ec-50ug EnQuireBio 50ug 522 EUR

    Recombinant S. cerevisiae SPT15 Protein, His, Yeast-1mg

    QP6764-ye-1mg EnQuireBio 1mg 3296.4 EUR

    Recombinant Human IL 24 Protein, Untagged, S. cerevisiae-10ug

    QP10705-10ug EnQuireBio 10ug 241.2 EUR

    Recombinant S. cerevisiae SPT15 Protein, His, E.coli-100ug

    QP6764-ec-100ug EnQuireBio 100ug 848.4 EUR

    Recombinant S. cerevisiae SPT15 Protein, His, E.coli-200ug

    QP6764-ec-200ug EnQuireBio 200ug 1338 EUR

    Recombinant S. cerevisiae SPT15 Protein, His, E.coli-500ug

    QP6764-ec-500ug EnQuireBio 500ug 1816.8 EUR

    Recombinant S. cerevisiae SPT15 Protein, His, Yeast-10ug

    QP6764-ye-10ug EnQuireBio 10ug 434.4 EUR

    Recombinant S. cerevisiae SPT15 Protein, His, Yeast-50ug

    QP6764-ye-50ug EnQuireBio 50ug 576 EUR

    Recombinant Human Insulin Protein, Untagged, S. cerevisiae-25mg

    QP10732-25mg EnQuireBio 25mg 218.4 EUR

    Recombinant Human IL 24 Protein, Untagged, S. cerevisiae-1mg

    QP10705-1mg EnQuireBio 1mg 4287.6 EUR

    Recombinant Human IL 24 Protein, Untagged, S. cerevisiae-2ug

    QP10705-2ug EnQuireBio 2ug 186 EUR

    Recombinant S. cerevisiae SPT15 Protein, His, Yeast-100ug

    QP6764-ye-100ug EnQuireBio 100ug 945.6 EUR

    Recombinant S. cerevisiae SPT15 Protein, His, Yeast-200ug

    QP6764-ye-200ug EnQuireBio 200ug 1512 EUR

    Recombinant S. cerevisiae SPT15 Protein, His, Yeast-500ug

    QP6764-ye-500ug EnQuireBio 500ug 2164.8 EUR

    Recombinant Human Insulin Protein, Untagged, S. cerevisiae-2mg

    QP10732-2mg EnQuireBio 2mg 186 EUR

    Recombinant HPV-16 L1 Protein (Full Length) (S. cerevisiae)

    VAng-Lsx0271-inquire Creative Biolabs inquire Ask for price

    Recombinant S. cerevisiae HYP2 Protein, His-SUMO, E.coli-1mg

    QP5977-ec-1mg EnQuireBio 1mg 2763.6 EUR

    Recombinant S. cerevisiae DDP1 Protein, His-SUMO, E.coli-1mg

    QP8030-ec-1mg EnQuireBio 1mg 2763.6 EUR

    Recombinant S. cerevisiae HYP2 Protein, His-SUMO, E.coli-10ug

    QP5977-ec-10ug EnQuireBio 10ug 391.2 EUR

    Recombinant S. cerevisiae HYP2 Protein, His-SUMO, E.coli-50ug

    QP5977-ec-50ug EnQuireBio 50ug 522 EUR

    Recombinant S. cerevisiae DDP1 Protein, His-SUMO, E.coli-10ug

    QP8030-ec-10ug EnQuireBio 10ug 391.2 EUR

    Recombinant S. cerevisiae DDP1 Protein, His-SUMO, E.coli-50ug

    QP8030-ec-50ug EnQuireBio 50ug 522 EUR

    Recombinant S. cerevisiae RAD52 Protein, His-SUMO, E.coli-1mg

    QP7366-ec-1mg EnQuireBio 1mg 2763.6 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Nicotinamidase Protein, His, E.coli-10ug

    QP7235-ec-10ug EnQuireBio 10ug 391.2 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Nicotinamidase Protein, His, E.coli-1mg

    QP7235-ec-1mg EnQuireBio 1mg 2763.6 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Nicotinamidase Protein, His, E.coli-50ug

    QP7235-ec-50ug EnQuireBio 50ug 522 EUR

    Recombinant S. cerevisiae HYP2 Protein, His-SUMO, E.coli-100ug

    QP5977-ec-100ug EnQuireBio 100ug 848.4 EUR

    Recombinant S. cerevisiae HYP2 Protein, His-SUMO, E.coli-200ug

    QP5977-ec-200ug EnQuireBio 200ug 1338 EUR

    Recombinant S. cerevisiae HYP2 Protein, His-SUMO, E.coli-500ug

    QP5977-ec-500ug EnQuireBio 500ug 1816.8 EUR

    Recombinant S. cerevisiae DDP1 Protein, His-SUMO, E.coli-100ug

    QP8030-ec-100ug EnQuireBio 100ug 848.4 EUR

    Recombinant S. cerevisiae DDP1 Protein, His-SUMO, E.coli-200ug

    QP8030-ec-200ug EnQuireBio 200ug 1338 EUR

    Recombinant S. cerevisiae DDP1 Protein, His-SUMO, E.coli-500ug

    QP8030-ec-500ug EnQuireBio 500ug 1816.8 EUR

    Recombinant S. cerevisiae RAD52 Protein, His-SUMO, E.coli-10ug

    QP7366-ec-10ug EnQuireBio 10ug 391.2 EUR

    Recombinant S. cerevisiae RAD52 Protein, His-SUMO, E.coli-50ug

    QP7366-ec-50ug EnQuireBio 50ug 522 EUR

    Recombinant S. cerevisiae RAD52 Protein, His-SUMO, E.coli-100ug

    QP7366-ec-100ug EnQuireBio 100ug 848.4 EUR

    Recombinant S. cerevisiae RAD52 Protein, His-SUMO, E.coli-200ug

    QP7366-ec-200ug EnQuireBio 200ug 1338 EUR

    Recombinant S. cerevisiae RAD52 Protein, His-SUMO, E.coli-500ug

    QP7366-ec-500ug EnQuireBio 500ug 1816.8 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Nicotinamidase Protein, His, E.coli-100ug

    QP7235-ec-100ug EnQuireBio 100ug 848.4 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Nicotinamidase Protein, His, E.coli-200ug

    QP7235-ec-200ug EnQuireBio 200ug 1338 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Nicotinamidase Protein, His, E.coli-500ug

    QP7235-ec-500ug EnQuireBio 500ug 1816.8 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Exopolyphosphatase Protein, His, E.coli-10ug

    QP7169-ec-10ug EnQuireBio 10ug 391.2 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Exopolyphosphatase Protein, His, E.coli-1mg

    QP7169-ec-1mg EnQuireBio 1mg 2763.6 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Exopolyphosphatase Protein, His, E.coli-50ug

    QP7169-ec-50ug EnQuireBio 50ug 522 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Neutral trehalase Protein, His, E.coli-10ug

    QP8922-ec-10ug EnQuireBio 10ug 391.2 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Neutral trehalase Protein, His, E.coli-1mg

    QP8922-ec-1mg EnQuireBio 1mg 2763.6 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Neutral trehalase Protein, His, E.coli-50ug

    QP8922-ec-50ug EnQuireBio 50ug 522 EUR

    Recombinant Saccharomyces Cerevisiae MER1 Protein (aa 1-270) [His]

    VAng-Wyb5023-1mg Creative Biolabs 1 mg 5140.8 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Exopolyphosphatase Protein, His, E.coli-100ug

    QP7169-ec-100ug EnQuireBio 100ug 848.4 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Exopolyphosphatase Protein, His, E.coli-200ug

    QP7169-ec-200ug EnQuireBio 200ug 1338 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Exopolyphosphatase Protein, His, E.coli-500ug

    QP7169-ec-500ug EnQuireBio 500ug 1816.8 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Neutral trehalase Protein, His, E.coli-100ug

    QP8922-ec-100ug EnQuireBio 100ug 848.4 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Neutral trehalase Protein, His, E.coli-200ug

    QP8922-ec-200ug EnQuireBio 200ug 1338 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Neutral trehalase Protein, His, E.coli-500ug

    QP8922-ec-500ug EnQuireBio 500ug 1816.8 EUR

    Recombinant other HSP104 Saccharomyces Protein, Untagged, S. cerevisiae-10ug

    QP12325-10ug EnQuireBio 10ug 186 EUR

    Recombinant other HSP104 Saccharomyces Protein, Untagged, S. cerevisiae-50ug

    QP12325-50ug EnQuireBio 50ug 241.2 EUR

    Recombinant other HSP104 Saccharomyces Protein, Untagged, S. cerevisiae-1mg

    QP12325-1mg EnQuireBio 1mg 1752 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Pyruvate kinase 1 Protein, His, Yeast-1mg

    QP9627-ye-1mg EnQuireBio 1mg 3296.4 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Adenosylhomocysteinase Protein, His, E.coli-10ug

    QP8805-ec-10ug EnQuireBio 10ug 391.2 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Adenosylhomocysteinase Protein, His, E.coli-1mg

    QP8805-ec-1mg EnQuireBio 1mg 2763.6 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Adenosylhomocysteinase Protein, His, E.coli-50ug

    QP8805-ec-50ug EnQuireBio 50ug 522 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Pyruvate kinase 1 Protein, His, Yeast-100ug

    QP9627-ye-100ug EnQuireBio 100ug 945.6 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Pyruvate kinase 1 Protein, His, Yeast-10ug

    QP9627-ye-10ug EnQuireBio 10ug 434.4 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Pyruvate kinase 1 Protein, His, Yeast-200ug

    QP9627-ye-200ug EnQuireBio 200ug 1512 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Pyruvate kinase 1 Protein, His, Yeast-500ug

    QP9627-ye-500ug EnQuireBio 500ug 2164.8 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Pyruvate kinase 1 Protein, His, Yeast-50ug

    QP9627-ye-50ug EnQuireBio 50ug 576 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Adenosylhomocysteinase Protein, His, E.coli-100ug

    QP8805-ec-100ug EnQuireBio 100ug 848.4 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Adenosylhomocysteinase Protein, His, E.coli-200ug

    QP8805-ec-200ug EnQuireBio 200ug 1338 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Adenosylhomocysteinase Protein, His, E.coli-500ug

    QP8805-ec-500ug EnQuireBio 500ug 1816.8 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Trehalose-phosphatase Protein, His, E.coli-10ug

    QP8863-ec-10ug EnQuireBio 10ug 391.2 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Trehalose-phosphatase Protein, His, E.coli-1mg

    QP8863-ec-1mg EnQuireBio 1mg 2763.6 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Trehalose-phosphatase Protein, His, E.coli-50ug

    QP8863-ec-50ug EnQuireBio 50ug 522 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Pyruvate carboxylase 1 Protein, His, E.coli-1mg

    QP7045-ec-1mg EnQuireBio 1mg 2763.6 EUR

    Recombinant Saccharomyces Cerevisiae NAT2 Protein (aa 1-288) [His]

    VAng-Wyb5152-1mg Creative Biolabs 1 mg 5227.2 EUR

    Recombinant Saccharomyces Cerevisiae NAT3 Protein (aa 1-195) [His]

    VAng-Wyb5153-1mg Creative Biolabs 1 mg 4789.2 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Trehalose-phosphatase Protein, His, E.coli-100ug

    QP8863-ec-100ug EnQuireBio 100ug 848.4 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Trehalose-phosphatase Protein, His, E.coli-200ug

    QP8863-ec-200ug EnQuireBio 200ug 1338 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Trehalose-phosphatase Protein, His, E.coli-500ug

    QP8863-ec-500ug EnQuireBio 500ug 1816.8 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Pyruvate carboxylase 1 Protein, His, E.coli-100ug

    QP7045-ec-100ug EnQuireBio 100ug 848.4 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Pyruvate carboxylase 1 Protein, His, E.coli-200ug

    QP7045-ec-200ug EnQuireBio 200ug 1338 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Pyruvate carboxylase 1 Protein, His, E.coli-500ug

    QP7045-ec-500ug EnQuireBio 500ug 1816.8 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Pyruvate carboxylase 1 Protein, His, E.coli-50ug

    QP7045-ec-50ug EnQuireBio 50ug 522 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Pyruvate carboxylase 1 Protein, His, Yeast-10ug

    QP7045-ye-10ug EnQuireBio 10ug 434.4 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Pyruvate carboxylase 1 Protein, His, Yeast-1mg

    QP7045-ye-1mg EnQuireBio 1mg 3296.4 EUR

    Recombinant S. cerevisiae Pyruvate carboxylase 1 Protein, His, Yeast-50ug

    QP7045-ye-50ug EnQuireBio 50ug 576 EUR

    Wśród nich wiązanie Dectyny-1 wykrywa się wyłącznie z oligomerami glukozy połączonymi wiązaniami 1,3 , przy czym minimalna długość wymagana do wykrywalnego wiązania to 10- lub 11- mer . Tak więc przydzielone dotychczas ligandy są raczej egzogenne niż endogenne. Ponadto pokazujemy, że ligandy dektyny-1, 11-13 gluko-oligomerów , w postaci skupionej (wyświetlanej na liposomach), naśladują wielkocząsteczkowe beta-glukany i konkurują z wiązaniem zymosanu i wyzwalaniem wydzielania czynnika martwicy nowotworu-alfa przez dektynę -1-ekspresjonująca linia komórkowa makrofagów.

Dodaj komentarz