Wszechstronny wektor do transferu genów i oligonukleotydów do komórek w hodowli i in vivo: polietylenoimina

• Kilka polikationów o znacznej zdolności buforowania poniżej fizjologicznego pH, takich jak lipopoliaminy i polimery poliamidoaminowe, jest skutecznymi środkami transfekcyjnymi per se, tj. bez dodawania środków nakierowanych na komórki lub rozrywających błony.
• Ta obserwacja skłoniła nas do przetestowania kationowego polimeru polietylenoiminy (PEI) pod kątem jego potencjału dostarczania genów. Rzeczywiście, co trzeci atom PEI jest protonowalnym atomem azotu aminowego, co sprawia, że ​​sieć polimerowa jest skuteczną „gąbką protonową” przy praktycznie każdym pH. Transfer genu reporterowego lucyferazy z tą polikationem do różnych linii komórkowych i komórek pierwotnych dał wyniki porównywalne lub nawet lepsze niż lipopoliaminy.
• Cytotoksyczność była niska i obserwowana tylko w stężeniach znacznie wyższych od wymaganych do optymalnej transfekcji. Po dostarczeniu oligonukleotydów do neuronów embrionalnych zastosowano   sondę fluorescencyjną . Praktycznie wszystkie neurony wykazywały oznakowanie jądrowe, bez efektów toksycznych. Optymalna równowaga kation/anion PEI dla transfekcji in vitro jest tylko nieznacznie po stronie kationowej, co jest korzystne dla dostarczania in vivo.
• Rzeczywiście, wewnątrzmózgowe przeniesienie genu lucyferazy do nowonarodzonych myszy dało wyniki porównywalne (dla danej ilości DNA) z transfekcją in vitro pierwotnych komórek śródbłonka mózgu szczura lub neuronów zarodków kurzych. Razem te właściwości sprawiają, że PEI jest obiecującym wektorem do terapii genowej i znakomitym rdzeniem do projektowania bardziej wyrafinowanych urządzeń. Nasza hipoteza jest taka, że ​​jego skuteczność opiera się na intensywnym buforowaniu lizosomów, które chroni DNA przed degradacją przez nukleazy, a w konsekwencji pęcznieniem i pękaniem lizosomów, które zapewniają mechanizm ucieczki dla  cząstek PEI/DNA .

Pomiar ruchliwości poprzez analizę kinetyki odzyskiwania fluorescencji fotowybielania.

1. Odzyskiwanie po wybielaniu fluorescencyjnym (FPR) oznacza metodę pomiaru dwuwymiarowej mobilności bocznej  cząstek fluorescencyjnych  , na przykład ruchu  cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie w około 10 obszarach mum2 powierzchni pojedynczej komórki.
2. Mała plamka na fluorescencyjnej  powierzchni jest fotowybielana przez krótką ekspozycję na intensywnie zogniskowaną wiązkę laserową, a następnie powrót fluorescencji jest monitorowany przez tę samą, ale osłabioną wiązkę laserową.
3. Odzyskiwanie następuje przez uzupełnienie nienaruszonego fluoroforu w wyblakłym miejscu przez transport boczny z otaczającej powierzchni . Przedstawiamy podstawy teoretyczne i kilka praktycznych wskazówek do prostej, rygorystycznej analizy eksperymentów FPR.
4. Informacje uzyskane z eksperymentów FPR obejmują: (a) identyfikację typu procesu transportu, tj. domieszki losowej dyfuzji i jednorodnego ukierunkowanego przepływu; (b) wyznaczenie bezwzględnego współczynnika mobilności, tj. stałej dyfuzji i/lub prędkości przepływu; oraz (c) część całkowitego fluoroforu, która jest ruchliwa.
5. Aby zilustrować metodę eksperymentalną i zweryfikować teorię dyfuzji, opisujemy kilka eksperymentów modelowych na wodnych roztworach rodaminy 6G.

Precyzyjna analiza lokalizacji w nanometrach dla poszczególnych   sond fluorescencyjnych .

1. Obliczenie centroidu obrazów poszczególnych  cząstek i cząsteczek fluorescencyjnych   umożliwia lokalizację i śledzenie w mikroskopach świetlnych z dokładnością o rząd wielkości większą niż rozdzielczość mikroskopu.
2. Zbadano czynniki ograniczające precyzję tych technik i wyprowadzono proste równanie opisujące precyzję lokalizacji w szerokim zakresie warunków. Ponadto konstruuje się algorytm lokalizacji oparty na teorii dopasowania najmniejszych kwadratów i testuje go zarówno na stosach obrazów 30-nm  kulek fluorescencyjnych  , jak i na obrazach generowanych komputerowo (symulacje Monte Carlo).
3. Wyniki algorytmu wykazują dobrą zgodność z otrzymanym równaniem precyzji zarówno dla symulacji, jak i rzeczywistych obrazów.
4. Dostępność prostego równania opisującego precyzję lokalizacji pomaga badaczom zarówno w ocenie jakości aparatury doświadczalnej, jak i w zwróceniu uwagi na czynniki ograniczające dalsze doskonalenie. Dokładność lokalizacji jest skalowana jako odwrotność pierwiastka kwadratowego liczby fotonów w miejscu dla przypadku ograniczenia szumu śrutowego oraz jako odwrotność liczby fotonów dla przypadku ograniczenia szumu tła.
5. Optymalne powiększenie obrazu zależy od oczekiwanej liczby fotonów i szumu tła, ale w większości przypadków rozmiar piksela powinien być w przybliżeniu równy odchyleniu standardowemu funkcji rozproszenia punktów.

Zależna od wielkości internalizacja  cząstek  poprzez szlaki endocytozy zależnej od klatryny i kaweoli.

1. Niefagocytarne komórki eukariotyczne mogą internalizować  cząstki o wielkości  <1 mikrona, obejmujące patogeny, liposomy do dostarczania leków lub lipopleksy stosowane do dostarczania genów.
2. W niniejszym badaniu zbadaliśmy wpływ  wielkości cząstek  na drogę wnikania i dalszy los wewnątrzkomórkowy w niefagocytujących komórkach B16, stosując szereg  fluorescencyjnych  kulek lateksowych o określonych rozmiarach (50-1000 nm).
3. Nasze dane ujawniają, że  cząstki  o wielkości nawet 500 nm zostały zinternalizowane przez komórki w procesie zależnym od energii. Wraz ze wzrostem wielkości (50-500 nm) ubytek cholesterolu zwiększał skuteczność hamowania wychwytu.
4. Przetwarzanie mniejszych  cząstek  było znacznie zaburzone w wyniku rozerwania mikrotubul, przy jednoczesnym znikomym wpływie na kulki 500 nm .
5. Badania inhibitorów i kolokalizacji wykazały, że mechanizm internalizacji kulek i ich późniejszego kierowania wewnątrzkomórkowego był silnie zależny od  wielkości cząstek  . Internalizacja mikrosfer o średnicy <200 nm dotyczyła jamek pokrytych klatryną.
6. Wraz ze wzrostem rozmiaru widoczne stało się przejście do mechanizmu, który opierał się na internalizacji za pośrednictwem kaweoli, co stało się dominującą ścieżką wnikania  cząstek  o wielkości 500 nm.
7. W tych warunkach dostarczanie do lizosomów nie było już widoczne. Dane wskazują, że sam rozmiar (pozbawionych ligandów)  cząstek  może determinować drogę wejścia.
8. Szlak endocytozy, w którym pośredniczy klatryna, wykazuje górną granicę rozmiaru dla internalizacji około. 200 nm, a parametry kinetyczne mogą decydować o prawie wyłącznej internalizacji takich  cząstek  wzdłuż tej ścieżki, a nie przez kaweole.

Immunofluorescencja w komórkach pochodzących z chłoniaka Burkitta.

Henle, Gertrude (Szpital Dziecięcy w Filadelfii, Filadelfia, Pensylwania) i Werner Henle. Immunofluorescencja w komórkach pochodzących z chłoniaka Burkitta. J. Bakteriol. 91:1248-1256. 1966.-Testy immunofluorescencji pośredniej doprowadziły do ​​doskonałego barwienia niewielkiej części komórek w pięciu różnych hodowlach pochodzących z chłoniaków Burkitta (afrykańskiego).

Reakcja nie była ograniczona do 17 surowic z przypadków tej choroby, ale rozszerzona na wiele surowic od osób amerykańskich, zarówno zdrowych dawców, jak i pacjentów cierpiących na różne choroby. Częstość występowania dodatnich surowic wzrastała z wiekiem od około 30% w dzieciństwie do >> 90% u dorosłych. Ludzkie gamma-globuliny sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny były odpowiednie do bezpośredniego barwienia tej samej proporcji komórek.

Wybarwione komórki wydawały się być w różnych stadiach zwyrodnienia, ale warunki hodowlane prowadzące do wzrostu odsetka śmierci komórek nie spowodowały wzrostu   komórek fluorescencyjnych . Kilka obserwacji sugeruje, że barwiące się komórki mogą być tymi, w których widoczne są  cząsteczki wirusa  pod mikroskopem elektronowym.

Dwie linie komórkowe pochodzące od pacjentów z białaczką w tym kraju również zawierały niewielką część komórek nadających się do barwienia, ale dwie inne i liczne pierwotne hodowle ludzkich leukocytów dawały konsekwentnie negatywne wyniki. Próby powiązania barwienia ze znanymi antygenami wirusowymi nie powiodły się w związku z wirusami opryszczki pospolitej, ospy wietrznej, cytomegalii i reo typu 1, 2 i 3. Charakter wirusa przenoszonego przez komórki chłoniaka, jak również reakcje barwienia pozostają do być zdeterminowanym.